Investigadores del Centro de Microbiología Sintética de Marburg de Alemania presentaron un sistema de edición del genoma sin cicatrices ni marcadores, denominada CRISPR SWAPnDROP que le permite al científico realizar ediciones consecutivamente o en paralelo y transferir regiones cromosómicas independiente del tamaño de las especies y con altas eficiencias de edición.
El estudio publicado en Nature Communications detalló cómo mediante CRISPR SWAPnDROP se pudo igualar los actuales sistemas de edición basados en CRISPR-Cas9 con una alta eficiencia de edición de más del 90 %, al tiempo que integra características deseables de varios sistemas con alta flexibilidad. Los investigadores demostraron con éxito la edición, la transferencia y la integración de grandes regiones cromosómicas.
La nueva técnica, amplía los límites de la edición del genoma a la transferencia de ADN en vivo a gran escala entre especies bacterianas. Su enfoque de plataforma modular facilita la adaptación específica de especies para conferir la edición del genoma en varias especies. “En este estudio, mostramos la implementación del concepto CRISPR SWAPnDROP para el organismo modelo Escherichia coli , el Vibrio natriegens de crecimiento rápido y el patógeno de plantas Dickeya dadantii”, detalla el informe publicado.
La técnica proporciona enfoques comunes de edición del genoma que comprenden inserciones y eliminaciones sin cicatrices, sin marcadores, iterativas y paralelas. Su sistema de coselección multicolor sin cicatrices mejora en gran medida la eficiencia de edición y proporciona controles de calidad visual durante el proceso de montaje y edición.
Los investigadores utilizaron un enfoque de coselección que no se basa en inserciones cromosómicas u otras cicatrices persistentes a través de su sistema de coselección multicolor. También pudieron aumentar la eficiencia de edición y monitorear el proceso de ensamblaje del sistema modular CRISPR SWAPnDROP.
CÓMO FUNCIONA
CRISPR SWAPnDROP se basa en la recombinación homóloga de ADN lineal de doble cadena. Permite la inserción y eliminación, así como la transferencia de grandes fragmentos de ADN entre cepas o especies. Para inserciones y deleciones (Indel) se utilizan dos homologías flanqueantes (HA, HB) para la integración cromosómica del inserto (INS).
El fragmento HA-INS-HB se libera de un plásmido dentro de la célula por restricción con Cas9. Además, Cas9 se utiliza como contraselector utilizando ARNsg específicos de locus expresados a partir del mismo plásmido. Para la transferencia de ADN entre células, el ADN cromosómico se carga en el plásmido mediante otro conjunto de homologías (H1, H2) que coinciden con los flancos del fragmento cromosómico (Swap).
La coselección CRISPR SWAPnDROP se basa en la eliminación del gen vioC del plásmido pSwap mediante la escisión mediada por CRISPR/Cas9 y la posterior recombinación tras la inducción
SU IMPOTRANCIA
El sistema de selección multicolor introducido en este estudio mejora la eficiencia de edición al seleccionar la mayor parte de los mutantes supresores que en conceptos anteriores forman parte de los clones seleccionados para ediciones exitosas. Su mecanismo proporciona control de calidad para los sistemas de restricción y recombinación involucrados en la edición. En general, se basa en la edición paralela nacida de plásmidos con un fenotipo claro. Este concepto se realiza mediante violencia mediada por Cas9 .eliminación y posterior recombinación para reconstituir el plásmido pSwap.
Fuente: ISAAA Inc.
